75915022
 

ЭКСПЕРТНОЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПЯТЕН КРОВИ НА СОРОЧКЕ НИКОЛАЯ II

Транскрипт (часть1)


Е.Г. Трынова, Цитович Т.Н., Вылегжанина Е.Я., Бандуренко Н.А. ЭКСПЕРТНОЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПЯТЕН КРОВИ НА СОРОЧКЕ НИКОЛАЯ II Свердловское областное бюро судебно-медицинской экспертизы (начальник к.м.н. Н.И. Неволин) В статье изложены результаты молекулярно-генетической экспертизы пятен крови на сорочке, хранящейся в Государственном Эрмитаже г. Санкт-Петербурга. Данное исследование проводилось в рамках комплексной международной экспертизы идентификации скелетированных останков 9-ти скелетов обнаруженных в 1991 году в районе Коптяковской дороги близ Екатеринбурга и идентифицированных ранее как останки императора и членов его семьи и близкого окружения, а также неопознанных человеческих останков, обнаруженных в 2007 году в захоронении на местности Поросенков Лог вблизи Екатеринбурга. С точки зрения современной криминалистики результаты данного исследования предоставляют возможность достигнуть доказательной значимости в вопросе идентификации останков императора. Впервые описан опыт успешного STR-типирования ДНК выделенной из пятен крови 117-летней давности на основе автоматического флюоресцентного анализа ПЦР-продуктов. Ключевые слова: геномная ДНК, STR-анализ, идентификация личности, Император Николай II 1.Представление 1.1 Введение Для идентификации предполагаемых останков царя Романова и членов его семьи из первого и второго захоронения необходимо повысить величину надѐжности ДНКидентификации до такого уровня, чтобы не было сомнений в уникальности генотипа останков. Предпринятые ранее попытки выявить индивидуализирующие признаки на уровне ДНК следов крови на объектах, хранящихся в культурном центре Бивако в г.отцу успехов не принесли и были прекращены как не имеющие экспертной перспективы. Однако современный уровень криминалистических молекулярногенетических исследований с использованием современной чувствительной аппаратуры и реактивов позволяют провести более полное и развернутое исследование дополнительных идентификационных признаков ядерной ДНК и как следствие, повысить идентификационную значимость проведенных исследований. Весной этого года появилась уникальная возможность провести прямую генетическую идентификацию останков последнего российского императора с высокой степенью достоверности. Выяснилось, что в хранилище Государственного Эрмитажа г. Санкт - Петербурга находится ценный и доселе не известный широкой общественности экспонат это сорочка. В связи с этим Генеральной прокуратурой Российской Федерации принято решение провести молекулярногенетическую экспертизу ДНК крови на сорочке, для того чтобы сравнить полученный генетический профиль с профилем ДНК костей, найденных неподалеку от Екатеринбурга. В случае положительных результатов экспертизы удастся развеять сомнения общественности в принадлежности «царских костей» семье Николая Александровича Романова. 1.2 Предварительные сведения Молекулярно-генетическое исследование пятен крови на сорочке проводились на основании постановления Генеральной прокуратуры Российской Федерации о назначении судебногенетической экспертизы на базе молекулярно-генетической лаборатории биологического отделения Свердловского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. На разрешение экспертов был поставлен следующий вопрос: 1) Возможно ли извлечение генетического материала из представленных на исследование предметов фетровый котелок и сорочка, принадлежащие цесаревичу Николаю Романову и хранящиеся в государственном Эрмитаже г.Санкт-петербурга? 2) Если да, то установить генотип Николая II? 7 августа 2008 года в Государственный Эрмитаж г. Санкт-Петербург для работы с ценными экспонатами прибыли: - старший следователь по особо важным делам Следственного комитета Генпрокуратуры РФ Соловьев Владимир Николаевич, - судебно-медицинский эксперткриминалист Московского бюро судебномедицинской экспертизы Никитин Сергей Алексеевич, - ведущий российский генетик профессор Рогаев Евгений Иванович - судебно-медицинский эксперт молекулярно-генетической лаборатории Свердловского областного бюро судебномедицинской экспертизы Трынова Елена Геннадьевна. Перед экспертами в области молекулярно-генетического исследования стояла сложнейшая задача - изъять пригодный для молекулярногенетического исследования материал, в частности образцы крови с фетрового котелка и сорочки, и при этом не повредить исторически ценные экспонаты. Изъятие материала для исследования должно было проводиться исключительно в рамках стен хранилища Эрмитажа под присмотром реставраторов и хранителей музея после предварительного согласования всех манипуляции. Главное условие полностью исключить такие методы изъятия объекта для исследования, как вырезка или выдергивание ниточек материала из предмета исследования. После предварительного обсуждения плана работы и приемлемых методов изъятия материала экспертам позволили делать смывы и соскобы с экспонатов. 1.3 Историческая справка По историческим сведениям в 1891 году наследник российского престола цесаревич Николай Романов совершал кругосветное путешествие. На пути во Владивосток он посетил Японию. 29 апреля 1891 года во время путешествия по Японии венценосный путешественник проезжал в повозке рикши близ Киото (г. Отцу), один из местных полицейских, стоявших в оцеплении, вдруг бросился с саблей на будущего российского царя и нанес ему несколько ударов по голове. В этот момент Николай обернулся, и клинок соскользнул, лишь слегка ранив будущего русского императора. Хранящиеся в Эрмитаже фетровый котелок и рубашка с пятнами крови это та самая одежда, в которую был облачен юный Николай Романов в момент покушения на его жизнь. Приближенные Николая сохранили одежду, в которую будущий император был одет во время визита в Японию, как реликвию. В Государственный Эрмитаж, в отдел истории русской культуры рубашка и фетровый котелок царя Николая попали в 1931 году из музея Революции, о чем свидетельствуют архивные лейблы, прикрепленные с помощью бечевки к фетровому котелку и манжету левого рукава сорочки. 2. Объект исследования На исследование были представлены фетровый котелок и сорочка цесаревича Николая Романова. На фетровом котелке с внутренней стороны на кожаном ободке имеется пятно крови, впитавшееся в кожу. Учитывая характер и давность пятна, а также характер предмета-носителя, с фетрового котелка пятно крови не смывалось и не исследовалось. На сорочке из тонкого, мягкого, льняного материала цвета слоновой кости в области правой манишки, правой части воротника и манжета правого рукава имелись многочисленные пятна крови хорошей насыщенности с пропитыванием материала. Вследствие давности пятен крови и характера предмета-носителя кровь растворению в дистиллированной воде не поддавалась. Однако воротничок, манжеты и манишка выполнены с укреплением материала и поэтому приобрели некоторые гидрофобные свойства, которые не позволили крови полностью впитаться в материал, а высохнуть с образованием корочек малых размеров от 1 2 мм до 5 5 мм. В связи с этим для молекулярно-генетического исследования из столь малых пятен были сделаны соскобы на стерильные фрагменты марли, предварительно смоченные дистиллированной водой. Объекты для исследования были изъяты с трѐх областей сорочки с правой стороны манишки (пятно 1), со стойки воротничка справа с внутренней стороны в 1 см от правого плечевого шва в сторону спинки (пятно 2), с внутренней части манжета правого рукава (пятно 3) Данный метод изъятия биологического объекта давал одно главное и очень важное преимущество меньшая площадь изъятия биологического объекта для исследования уменьшает потенциальную опасность контаминации экзогенной ДНК и ингибиторами реакции ПЦР. Кроме этого, данный метод изъятия объекта полностью исключал влияние предметаносителя на выделение ДНК. Фрагменты марли с частичками крови помещались в подписанные полипропиленовые пробирки эппендорфы и тщательно просушивались. Полученные образцы доставлены в молекулярно-генетическую лабораторию биологического отделения Свердловского областного бюро судебно-медицинской экспертизы, где проведено выделение и последующий анализ ДНК, выделенной из образцов крови с сорочки последнего российского императора. Исследование и анализ полученных образцов проводился с 11 августа по 2 сентября 2008 года. 3.Материалы и методы 3.1 ДНК-выделение ДНК из изъятых корочек крови (пятна 1,2,3) выделялось методом органической экстракции с использованием набора для выделения ДНК «Extra Phen 100» (АТГ БИОТЕХ, г. Москва). Корочки крови экстрагировались лизирующим буфером с добавлением протеиназы К в течение 18 часов при температуре 37 С. Надосадочная жидкость подвергалась депротеинизации: смесью фенол/хлороформ и хлороформом. ДНК из водной фазы осаждалась 96% - этиловым спиртом с добавлением 5М ацетата аммония и выдерживалась в течение 1 часа при -20 С. После центрифугирования полученный преципитат ДНК промывался 75% спиртом, высушивался на воздухе и растворялся в 40 µl ТЕ-буфера. Данные препараты ДНК использовались в качестве матрицы для постановки реакции ПЦР. 3.2 Определение количества ДНК Определение количества выделенной геномной ДНК проводилось на приборе Applied Biosystems 7500 Real Time PCR Systems наборами реагентов Quantifiler Human для количественного анализа ДНК человека и Quantifiler Y для количественного анализа мужской ДНК Y-хромосомы фирмы Applied Biosystems (США), по методике, рекомендуемой фирмой-изготовителем. Обработка полученных данных проводилась на ПК в операционной системе Microsoft Windows XP c помощью программного обеспечения ABI Prism 7500 SDS Software. Данные интерпретировались после проведенного анализа стандартной кривой и системы внутреннего контроля ПЦР - IPC. Результаты представлены в таблице ПЦР-амплификация Для генетического типирования проб ДНК использовались наборы реагентов с пятью красителями для ПЦРамплификации AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit и AmpFlSTR. Локусы Yfiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США). Объекты исследования Количество аутосомной ДНК человека (нг/мкл) ТАБЛИЦА 1 Количество мужской ДНК Y- хромосомы (нг/мкл) (пятно 1) (пятно 2) (пятно 3) Примечание: Анализ системы внутреннего контроля ПЦР (IPC) показал отсутствие ингибиторов в растворе выделенной ДНК. Значения Ct для IPC находились в диапазоне ПЦР - амплификация (полимеразная цепная реакция) проб ДНК проводилась в соответствии с инструкцией к набору, рекомендуемой фирмой-производителем с незначительной модификацией. С целью уменьшить расход выделенной ДНК необходимой для постановки реакции ПЦР, амплификация проводилась в реакционном объеме 12,5 мкл, где объем ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь составил 5 мкл. Условия термического циклирования полностью соответствовали рекомендациям фирмы-производителя: - для набора AmpFlSTR Identifiler : 95 С - 11 мин; 28 циклов 94 С 1 мин, 59 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 60 мин. - для набора AmpFlSTR Yfiler : 95 С - 11 мин; 30 циклов 94 С 1 мин, 61 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 80 мин. В инструкции к набору AmpFlSTR Identifiler и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kits рекомендуемая концентрация ДНК вводимая в ПЦРреакцию должна быть в диапазоне 0,05 0,125нг/мкл. В нашем случае амплификация проводилась 3 раза с увеличением концентрации ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь до максимально возможной величины. Для ПЦР - амплификации использовался прибор ПЦР-амплификатор GeneAmp PCR System Анализ продуктов ПЦР-реакции Для установления генотипа проб ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке, применялась автоматическая система капиллярного электрофореза с использованием флуоресцентных красителей модель АВ 3130 Genetic Analyzer фирмы Applied Biosystems (США) с длиной каппиляров 36 см и полимером POP-4 рекомендуемых для фрагментного анализа. Полученные данные обрабатывались с использованием программного обеспечения для автоматического анализа данных GeneMapper ID Software v Результаты и обсуждение В препаратах ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке (пятна 1,2,3) и амплифицированных наборами AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit установлены генотипы и гаплотипы представленные в таблицах 2 и 3, соответственно. Таблица 2 STR генотипы 3-х пятен крови на сорочке Обьекты Концентрация ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь (пятно 1) 0,950 нг/мкл (пятно 2) (пятно 3) 2,06 нг/мкл 7,56 нг/мкл D8S , 15 13, 15 13, 15 D21S , , 33.2 D7S , 12 CSF1PO , 12 D3S , 17 14, 17 14, 17 THO1 7, - 7, 9.3 7, 9.3 D13S317 11, - 11, 12 11, 12 D16S , 14 D2S , 25 D19S433 13, , , 13.2 vwa 15, - 15, 16 15, 16 TPOX - 8, 11 8, 8 D18S , 17 D5S818 12, 12 12, 12 12, 12 FGA 22, - 22, - 20, 22 Amel XY XY XY Примечание: Цифрами в таблице обозначены номера аллелей (генетических признаков) в соответствии с принятой международной классификацией. При постановке реакции ПЦР с увеличением концентрации ДНК введенной в ПЦР-реакцию до максимально возможной величины в образце ДНК, выделенном из пятна крови Локусы Yfiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США). Объекты исследования Количество аутосомной ДНК человека (нг/мкл) ТАБЛИЦА 1 Количество мужской ДНК Y- хромосомы (нг/мкл) (пятно 1) (пятно 2) (пятно 3) Примечание: Анализ системы внутреннего контроля ПЦР (IPC) показал отсутствие ингибиторов в растворе выделенной ДНК. Значения Ct для IPC находились в диапазоне ПЦР - амплификация (полимеразная цепная реакция) проб ДНК проводилась в соответствии с инструкцией к набору, рекомендуемой фирмой-производителем с незначительной модификацией. С целью уменьшить расход выделенной ДНК необходимой для постановки реакции ПЦР, амплификация проводилась в реакционном объеме 12,5 мкл, где объем ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь составил 5 мкл. Условия термического циклирования полностью соответствовали рекомендациям фирмы-производителя: - для набора AmpFlSTR Identifiler : 95 С - 11 мин; 28 циклов 94 С 1 мин, 59 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 60 мин. - для набора AmpFlSTR Yfiler : 95 С - 11 мин; 30 циклов 94 С 1 мин, 61 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 80 мин. В инструкции к набору AmpFlSTR Identifiler и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kits рекомендуемая концентрация ДНК вводимая в ПЦРреакцию должна быть в диапазоне 0,05 0,125нг/мкл. В нашем случае амплификация проводилась 3 раза с увеличением концентрации ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь до максимально возможной величины. Для ПЦР - амплификации использовался прибор ПЦР-амплификатор GeneAmp PCR System Анализ продуктов ПЦР-реакции Для установления генотипа проб ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке, применялась автоматическая система капиллярного электрофореза с использованием флуоресцентных красителей модель АВ 3130 Genetic Analyzer фирмы Applied Biosystems (США) с длиной каппиляров 36 см и полимером POP-4 рекомендуемых для фрагментного анализа. Полученные данные обрабатывались с использованием программного обеспечения для автоматического анализа данных GeneMapper ID Software v Результаты и обсуждение В препаратах ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке (пятна 1,2,3) и амплифицированных наборами AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit установлены генотипы и гаплотипы представленные в таблицах 2 и 3, соответственно. Таблица 2 STR генотипы 3-х пятен крови на сорочке Обьекты Концентрация ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь (пятно 1) 0,950 нг/мкл (пятно 2) (пятно 3) 2,06 нг/мкл 7,56 нг/мкл D8S , 15 13, 15 13, 15 D21S , , 33.2 D7S , 12 CSF1PO , 12 D3S , 17 14, 17 14, 17 THO1 7, - 7, 9.3 7, 9.3 D13S317 11, - 11, 12 11, 12 D16S , 14 D2S , 25 D19S433 13, , , 13.2 vwa 15, - 15, 16 15, 16 TPOX - 8, 11 8, 8 D18S , 17 D5S818 12, 12 12, 12 12, 12 FGA 22, - 22, - 20, 22 Amel XY XY XY Примечание: Цифрами в таблице обозначены номера аллелей (генетических признаков) в соответствии с принятой международной классификацией. При постановке реакции ПЦР с увеличением концентрации ДНК введенной в ПЦР-реакцию до максимально возможной величины в образце ДНК, выделенном из пятна крови Локусы Yfiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США). Объекты исследования Количество аутосомной ДНК человека (нг/мкл) ТАБЛИЦА 1 Количество мужской ДНК Y- хромосомы (нг/мкл) (пятно 1) (пятно 2) (пятно 3) Примечание: Анализ системы внутреннего контроля ПЦР (IPC) показал отсутствие ингибиторов в растворе выделенной ДНК. Значения Ct для IPC находились в диапазоне ПЦР - амплификация (полимеразная цепная реакция) проб ДНК проводилась в соответствии с инструкцией к набору, рекомендуемой фирмой-производителем с незначительной модификацией. С целью уменьшить расход выделенной ДНК необходимой для постановки реакции ПЦР, амплификация проводилась в реакционном объеме 12,5 мкл, где объем ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь составил 5 мкл. Условия термического циклирования полностью соответствовали рекомендациям фирмы-производителя: - для набора AmpFlSTR Identifiler : 95 С - 11 мин; 28 циклов 94 С 1 мин, 59 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 60 мин. - для набора AmpFlSTR Yfiler : 95 С - 11 мин; 30 циклов 94 С 1 мин, 61 С 1 мин, 72 С 1 мин; 60 С - 80 мин. В инструкции к набору AmpFlSTR Identifiler и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kits рекомендуемая концентрация ДНК вводимая в ПЦРреакцию должна быть в диапазоне 0,05 0,125нг/мкл. В нашем случае амплификация проводилась 3 раза с увеличением концентрации ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь до максимально возможной величины. Для ПЦР - амплификации использовался прибор ПЦР-амплификатор GeneAmp PCR System Анализ продуктов ПЦР-реакции Для установления генотипа проб ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке, применялась автоматическая система капиллярного электрофореза с использованием флуоресцентных красителей модель АВ 3130 Genetic Analyzer фирмы Applied Biosystems (США) с длиной каппиляров 36 см и полимером POP-4 рекомендуемых для фрагментного анализа. Полученные данные обрабатывались с использованием программного обеспечения для автоматического анализа данных GeneMapper ID Software v Результаты и обсуждение В препаратах ДНК, выделенных из пятен крови на сорочке (пятна 1,2,3) и амплифицированных наборами AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit и AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit установлены генотипы и гаплотипы представленные в таблицах 2 и 3, соответственно. Таблица 2 STR генотипы 3-х пятен крови на сорочке Обьекты Концентрация ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь (пятно 1) 0,950 нг/мкл (пятно 2) (пятно 3) 2,06 нг/мкл 7,56 нг/мкл D8S , 15 13, 15 13, 15 D21S , , 33.2 D7S , 12 CSF1PO , 12 D3S , 17 14, 17 14, 17 THO1 7, - 7, 9.3 7, 9.3 D13S317 11, - 11, 12 11, 12 D16S , 14 D2S , 25 D19S433 13, , , 13.2 vwa 15, - 15, 16 15, 16 TPOX - 8, 11 8, 8 D18S , 17 D5S818 12, 12 12, 12 12, 12 FGA 22, - 22, - 20, 22 Amel XY XY XY Примечание: Цифрами в таблице обозначены номера аллелей (генетических признаков) в соответствии с принятой международной классификацией. При постановке реакции ПЦР с увеличением концентрации ДНК введенной в ПЦР-реакцию до максимально возможной величины в образце ДНК, выделенном из пятна крови




Транскрипт (Часть2)


Рис.1 Электрофореграмма результатов анализа ДНК, выделенных из пятна крови на сорочке (пятно 3), с использованием набора AmpFISTR Identifiler PCR по 15 STR-локусам и маркѐру половой принадлежности (Amel) на приборе AB 3130 Genetic Analyzer на рубашке (пятно 1) получен неполный 8-локусный генетип аутосомной ДНК и неполный 8-локусный гаплотип мужской ДНК Y- хромосомы. При исследовании образца ДНК, выделенного из пятна крови на рубашке (пятно 2) также получен неполный 10-локусный генетический профиль аутосомной ДНК и неполный 13- локусный генетический профиль мужской ДНК. Такую выборочную амплификацию в пользу локусов с меньшей длиной ампликонов можно объяснить деградацией ДНК вследствие давности происхождения пятна и воздействия различных факторов окружающей среды. С приближением средней длины деградированной ДНК к размеру амплифицирорванных последовательностей выход продукта ПЦР снижается. Это обусловлено снижением количества матриц с ненарушенной структурой с размером необходимым для амплификации. Самым результативным оказался профиль геномной ДНК выделенной из пятна крови на рубашке (пятно 3). В итоге был получен полный 16- локусный STR-профиль аутосомной ДНК (рис.1) и полный 17-локусный гаплотип ДНК Y- хромосомы образца крови с сорочки (рис.2). Данных результатов удалось достигнуть после введения в реакционную смесь максимально возможного в данном случае количества ДНК в 75,6 раз превышающего рекомендованную концентрацию для набора AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit и в 57,3 раза превышающего рекомендованную концентрацию для набора AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit. Только добавление большего количества ДНК к реакционной смеси помогло получить сигнал достаточный для типирования всех локусов, в том числе с большими длинами ампликонов. Таблица 3 STR гаплотипы 3-х пятен крови на сорочке Локус Концентрация ДНК-матрицы вводимой в реакционную смесь (пятно 1) 0,749 нг/мкл (пятно 2) (пятно 3) 1,53 нг/мкл 5,73 нг/мкл DYS DYS389I DYS DYS389II DYS DYS DYS385a,b 11, 14 11, 14 11, 14 DYS DYS DYS DYS DYS Y GATA H DYS DYS DYS Примечание: Цифрами в таблице обозначены номера аллелей (генетических признаков) в соответствии с принятой международной классификацией Рис.2 Электрофореграмма результатов анализа ДНК, выделенных из пятна крови на сорочке (пятно 3), с использованием набора AmpFISTR Yfiler PCR по 17 STRлокусам на приборе AB 3130 Genetic Analyzer геномной ДНК крови соответствующий требованиям нескольких международных баз данных. 3) Полученный результат открывает перспективу проведения новых важных сравнительных генетических исследований. Если принять условие, что костные останки, обнаруженные в 1991 году и идентифицированные ранее, являются костными останками последнего Российского Императора, а пятна крови на рубашке являются образом крови - то генотипические. На основании изложенных результатов проведенных исследований сделаны следующие выводы: 1) Впервые в международной криминалистической молекулярногенетической практике показан положительный опыт STR-типирования ДНК крови 117-летней давности. 2) Из пятен крови на сорочке, хранящейся в архиве Государственного Эрмитажа г. Санкт- Петербурга, получена геномная ДНК, проведѐн максимально результативный генетический STR-анализ по пятнадцати системам идентификации аутосомной ДНК и семнадцати системам идентификации мужской ДНК. В результате получен генетический профиль профили данных объектов исследования должны совпадать. Согласно мировой судебногенетической практике на сегодняшний день лишь генетическая идентификация останков человека по его образцами крови или слюны является самым достоверным анализом. При таком сравнительном анализе степень достоверности, т.е. вероятность совпадения генетических признаков по всем исследованным локусам у 2-х человек, может достигать уровня степени. Кроме этого, полученный результат позволит идентифицировать личность с очень высокой степенью вероятности 99, %. Данный уровень идентификационной значимости настолько велик, что отодвигают на второй план данные популяционной статистики. Именно благодаря столь высокой степени достоверности очень важно провести сравнительный анализ идентифицированных ранее костных останков (скелет 4), найденных в первом захоронении на Старой Коптяковской дороге под Екатеринбургом, и крови, обнаруженной на рубашке. Это позволит, наконец, поставить последнюю точку в вопросе идентификации личности и членов его семьи.





ОТЧЕТ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ КОСТНЫХ ОСТАНКОВ ЯВЛЕННЫХ в ПОРОСЕНКОВОМ ЛОГУБЛИЗ КОПТЯКОВСКОЙ ДОРОГИ г.ЕКАТЕРИНБУРГА в 2007 г.

Результаты категоричны - Цесаревич Алексей и Великая Княжна Мария!  (текст на русском языке)

Этот же материал. Только на английском языке.